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微生物分离与纯化是从混合菌群中获取单一菌株的关键过程。本文以分离土壤中放线菌、真菌、细菌为例，介绍了平板分离法在微生物分离与纯化中的广泛应用。由于其简便性和高效性，平板分离法能够通过不同的分离技术和合适的培养基，有效获得纯菌株，确保后续研究和应用的准确性。
1、稀释涂布平板法
稀释涂布平板法是一种通过梯度稀释菌液，并将其涂布在固体培养基表面，最终形成单个菌落的方法。其原理在于，在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。
具体步骤如下：
1）倒平板
将牛肉膏蛋白胨培养基、高氏1号培养基和PDA培养基溶解并冷却至55~60℃，分别加入特定的添加剂并混匀后倒入培养皿，每种培养基倒3皿（重复）。
2）制备土壤稀释液
a、 称取土壤：称取10g鲜土，放入含有90ml无菌水和玻璃珠的锥形瓶中。
b、混合土壤：在150r/min的摇床上震荡30分钟，使土壤与水充分混合，菌体完全分散。
c、逐级稀释：
吸取1ml土壤悬液注入第一支含有9ml无菌水的试管中，震荡混匀。
从第一支试管中吸取1ml悬液，注入第二支含有9ml无菌水的试管中，震荡混匀。
重复此过程，依次制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7稀释度的土壤溶液，待用。
3）涂布
a、制备平板：将灭菌的培养基倒入培养皿中，待平板冷却后使用。
b、涂布过程：将10-2和10-3稀释度的土壤菌悬液涂布在平板上进行放线菌的形态观察培养；将10-4和10-5稀释度的土壤菌悬液涂布在平板上进行真菌形态的观察培养；将10-6和10-7稀释度的土壤菌悬液涂布在平板上进行细菌的形态观察培养。
c、涂布技巧：先从下向上推开，再左右推开，后在培养基上半部分充分推开，转动培养基，将下半部分转至上方，重复上述推开操作。在转动过程中，涂布器不可伸出培养皿外，最后由中间向外转圈涂布，再由外向内进行转圈涂布均匀。
4）培养
倒置于30℃恒温培养箱内，细菌培养48小时，真菌和放线菌培养168小时。
5）纯化
挑取单菌落进行分离纯化3～4次，得到细菌纯种。
2、平板划线法
平板划线法是一种通过在平板表面划线稀释样品以获得单菌落的方法。其原理在于，每次划线都会导致接种环上的菌体分布更为疏松，最终实现单菌落的分离。
具体步骤如下：
1）划线区划分
将一个平板分为A、B、C、D四个区域，面积由小到大排列。
2）划线过程
使用接种环在每个区域划线，逐步稀释菌体，A 区为待分离的菌源区，B和C区为初步划线稀释的过渡区，D区（面积最大）则为关键的单菌落收获区。
3）培养
培养后观察D区单菌落，并进行分离纯化。
培养基选择
培养基类型选择：根据微生物种类和生长需求选择合适的培养基类型，如固体培养基或液体培养基。
营养成分：根据微生物的生长需求选择合适的碳源、氮源、矿物质和维生素等营养成分。
酸碱度调整：调整培养基的酸碱度以适应微生物生长。
培养条件：根据微生物需求调整温度、湿度和光照等培养条件。
常见问题
Q1：为什么在平板划线中，每次划线前都要灼烧接种环？
A1：每次划线前灼烧接种环以杀死残留菌种，确保下次划线的菌种纯度。
Q2：用平板划线法分离菌种，怎样保证得到相互分离的菌落？
A2：划线时估计样本中菌的数量，调整两区间的重叠线数。第一区一般很少能出来单个菌落，因此占平板面积不要太大，大面积留给后几区。
Q3：如何确定平板上的单菌落是否为纯培养？
A3：将单个菌落再次划线或稀释分离，如形成的单菌落形态单一，即为纯种菌落。
Q4：培养基接种后为何要倒置培养？
A4：①防止冷凝水滴落污染培养基；②防止培养基水分蒸发；③某种程度上防止菌落蔓延。
Q5：无菌操作的要点是什么？
A5：①保持试管口、瓶口或培养皿开缝处靠近酒精灯火焰区（保持无菌环境）；②试管口不向上，减少污染；③及时清除接种遗留物品，防止污染；④不同菌种接种时做好标记，避免混杂。